最近被派出去学习细胞实验，故以此文记录我的所学所闻，加深记忆与理解。

基本注意事项

  1. 即将进入培养箱与超净台的东西（比如自己的手、培养瓶、各种器材试剂等），必须事先喷洒酒精消毒。
  2. 进入细胞间第一件事，查看自己的细胞的密度、状态，想好今天需要做什么。
  3. 想好要做的实验之后，拿出试剂预热，如培养基、胰蛋白酶等。
  4. 将自己准备用的液体药品倒入单独的离心管里待用，而不是直接使用大瓶子里的液体，避免污染。

常用的体积

  1. 养细胞时的培养基用量：小瓶 5 mL，大瓶 15 mL；
  2. PBS 洗涤时的用量：小瓶 1 mL，大瓶 3 mL；
  3. 消化细胞时的胰酶用量：小瓶 1 mL，大瓶 3 mL；
  4. 我所在的实验室的完全培养基的配制：在基础培养基中加入 1%双抗 和 10%FBS。
  5. 铺共聚焦小皿时的细胞数：2 mL 细胞悬浮液，共计 10 万个细胞，培养两天后进行共聚焦成像，细胞不多不少、足够分散且状态良好。
  6. 对于八孔板，则是每孔铺 500 μL，共计 2.5 万个细胞。

消化细胞

  1. 从培养箱取出细胞，倒掉培养基；
  2. 使用 PBS 洗涤；
  3. 加入胰蛋白酶，放入培养箱消化 3 min；（需计时，太短则无法消化完全，太长则可能破坏细胞）；
  4. 取出细胞，检查状态，若消化完全，则可见细沙状沉淀，轻敲培养瓶外壁，可见脱落现象，液体混浊；若未消化完全，则继续培养直至消化完全；
  5. 加入培养基中止消化（培养基中的蛋白可以竞争胰酶对细胞的消化）（中止后，若手头还有其它实验要做，可以暂时停在这里一会儿，基本不会有问题）；
  6. 把瓶子里的液体转移至离心管，用每分钟 1000 转的速度离心 3 min；
  7. 取出离心管，倒掉液体，再用移液枪吸走残余液体；
  8. 用 1 mL 或 2 mL 培养基冲洗沉淀物，用移液枪冲匀液体，即可得细胞悬浮液（混匀悬浮液时，最好用枪头冲匀，不使用涡旋是因为力度可能太大、损伤细胞，不使用摇晃是因为可能混不匀）。

细胞计数

  1. 取细胞计数板，显微镜下观察是否洁净，若不洁净，则用酒精喷洒消毒；
  2. 取一小玻片，先在计数板两边滴加少量（约100μL）PBS，用枪头涂开、涂匀，将玻片覆盖在计数板上，利用刚才的 PBS 保证结合紧密；
  3. 稀释细胞悬浮液，通常稀释 10 倍，即取一个 1.5 μL EP 管，加入 900 μL PBS，加入 100 μL 细胞悬浮液，用枪头冲匀；
  4. 取 100 μL 稀释液，滴入计数板边缘，随后液体将因表面张力而被引入计数板的凹槽；
  5. 在显微镜下进行细胞计数，记录四个 4x4 方格内的总细胞数，然后取平均，每个 4x4 方格的体积可认为是 1x10^-4 mL，由此可推算母液的细胞密度。

爬片

  1. 用干净的镊子夹取玻片置于 12 孔板中；
  2. 每个孔都用 1 mL PBS 洗涤，洗涤后吸去 PBS，尽可能吸干净；
  3. 每个孔都加入 200 μL 聚赖氨酸 (PDL)，使玻片表面覆盖一层 PDL，放置至少 20 min；
  4. 将 PDL 吸走、回收；
  5. 用 PBS 洗涤每个孔，确保无游离的残余 PDL；
  6. 将预先稀释过的细胞悬浮液加入每个孔；
  7. 用摇床摇匀，然后将 12 孔板放入培养箱。

细胞传代

通常在瓶内加入培养基之后，直接加入上一代细胞的消化后的悬浮液即可，但某些细胞需要加 PDL 进行包被来帮助细胞贴壁。

  1. 培养瓶中加 PDL，放置至少 20 min；
  2. 回收 PDL，用 PBS 洗涤培养瓶；
  3. 加入培养基，然后再加入细胞悬浮液即可。

使用Hoechst染料为细胞核染色

  1. 弃去旧的培养基，使用 PBS 洗涤一次细胞（润洗一下即可）；
  2. 使用无酚红培养基稀释 Hoechst 染料母液，倍数为 1:1000；
  3. 将稀释后的染料加入目标细胞，37 °C 下避光孵育 10 min；
  4. 弃去孵育后的染料，用 PBS 洗涤三次细胞，每次加入后避光孵育 3 min；
  5. 此时已经完成染色，若细胞还需要在其它试剂下长期孵育（譬如要染色其它细胞器），则可以考虑使用稀释倍数为 1:10000 的 Hoechst 染料来配制试剂，以维持对细胞核的染色效果。

复苏细胞

  1. 取出在液氮或 -80 °C 冰箱中储存的细胞冻存管，在 37 °C 水浴下解冻；
  2. 完全解冻后，立刻将管内液体转入 15 mL 离心管，然后用 5 mL 完全培养基稀释（冻存液对细胞有毒性，所以动作要快）；
  3. 离心，弃去上清液，用少量培养基冲成细胞悬浮液，转入培养瓶即可。

冻存细胞

  1. 细胞量：在小培养瓶中铺满的细胞量（约 100 万个细胞）；
  2. 消化后离心，然后用 1 mL 冻存液成悬，迅速转入冻存管；
  3. 迅速转入 -80 °C 冰箱内保存。

IVIS系统使用

  1. 进入房间，打开除湿器和空调，打开电脑，pw=123456，打开软件；
  2. 待环境湿度低于 60%（最好低于 50%）后，打开 IVIS 仪器的电闸，IVIS 仪器自动开始降温；
  3. 在降温至约 -60 °C 时，打开麻醉系统，先打开麻醉仓的阀门，流速 2.5 （需要先按住按钮才可以转动旋钮），然后打开氮气泵，先开总阀，待指针稳定后再开小阀门至指针示数为 0.15；
  4. 在降温至 -80 °C 后（软件上可看到提示），在软件上点击 Initialize，初始化程序，进行成像参数的配置；
  5. 在麻醉盒内铺一张吸水纸，然后把小鼠置于仓内，盖紧盖子，可观察到小鼠先兴奋后昏迷，小鼠昏迷后再维持约30秒；
  6. 打开成像区的麻醉剂阀门，流速改为 1.5；
  7. 打开IVIS系统的门，将小鼠转移至成像区，先把头部塞入麻醉槽，然后摆好体位；
  8. 关门，在软件上点击 Acquire，采集图像；
  9. 成像系统工作时，门上的灯为红色，只有当灯转为绿色时，才可打开舱门，更换下一只待测小鼠；
  10. 结束成像后，关闭麻醉系统，先关闭氮气瓶总阀，然后关闭小阀门，然后随意关闭其余的开关即可；
  11. 直接推闸关闭 IVIS 仪器；
  12. 关闭电脑、加湿器、空调，打扫干净麻醉盒。

后记

在细胞间里待了两三天之后，我逃离 wet lab 的想法愈发坚定了。XD

添加新评论