细胞间注意事项及常见操作
最近被派出去学习细胞实验，故以此文记录我的所学所闻，加深记忆与理解。
基本注意事项
- 即将进入培养箱与超净台的东西（比如自己的手、培养瓶、各种器材试剂等），必须事先喷洒酒精消毒。
- 进入细胞间第一件事，查看自己的细胞的密度、状态，想好今天需要做什么。
- 想好要做的实验之后，拿出试剂预热，如培养基、胰蛋白酶等。
- 将自己准备用的液体药品倒入单独的离心管里待用，而不是直接使用大瓶子里的液体，避免污染。
常用的体积
- 养细胞时的培养基用量：小瓶 5 mL，大瓶 15 mL；
- PBS 洗涤时的用量：小瓶 1 mL，大瓶 3 mL；
- 消化细胞时的胰酶用量：小瓶 1 mL，大瓶 3 mL。
消化细胞
- 从培养箱取出细胞，倒掉培养基；
- 使用 PBS 洗涤；
- 加入胰蛋白酶，放入培养箱消化 3 min；（需计时，太短则无法消化完全，太长则可能破坏细胞）；
- 取出细胞，检查状态，若消化完全，则可见细沙状沉淀，轻敲培养瓶外壁，可见脱落现象，液体混浊；若未消化完全，则继续培养直至消化完全；
- 加入培养基中止消化（培养基中的蛋白可以竞争胰酶对细胞的消化）（中止后，若手头还有其它实验要做，可以暂时停在这里一会儿，基本不会有问题）；
- 把瓶子里的液体转移至离心管，用每分钟 1000 转的速度离心 3 min；
- 取出离心管，倒掉液体，再用移液枪吸走残余液体；
- 用 1 mL 或 2 mL 培养基冲洗沉淀物，用移液枪冲匀液体，即可得细胞悬浮液（混匀悬浮液时，最好用枪头冲匀，不使用涡旋是因为力度可能太大、损伤细胞，不使用摇晃是因为可能混不匀）。
细胞计数
- 取细胞计数板，显微镜下观察是否洁净，若不洁净，则用酒精喷洒消毒；
- 取一小玻片，先在计数板两边滴加少量（约100μL）PBS，用枪头涂开、涂匀，将玻片覆盖在计数板上，利用刚才的 PBS 保证结合紧密；
- 稀释细胞悬浮液，通常稀释 10 倍，即取一个 1.5 μL EP 管，加入 900 μL PBS，加入 100 μL 细胞悬浮液，用枪头冲匀；
- 取 100 μL 稀释液，滴入计数板边缘，随后液体将因表面张力而被引入计数板的凹槽；
- 在显微镜下进行细胞计数，记录四个 4x4 方格内的总细胞数，然后取平均，每个 4x4 方格的体积可认为是 1x10^-4 mL，由此可推算母液的细胞密度。
爬片
- 用干净的镊子夹取玻片置于 12 孔板中；
- 每个孔都用 1 mL PBS 洗涤，洗涤后吸去 PBS，尽可能吸干净；
- 每个孔都加入 200 μL 聚赖氨酸 (PDL)，使玻片表面覆盖一层 PDL，放置至少 10 min；
- 将 PDL 吸走、回收；
- 用 PBS 洗涤每个孔，确保无游离的残余 PDL；
- 将预先稀释过的细胞悬浮液加入每个孔；
- 用摇床摇匀，然后将 12 孔板放入培养箱。
细胞传代
通常在瓶内加入培养基之后，直接加入上一代细胞的消化后的悬浮液即可，但某些细胞需要加 PDL 来帮助细胞贴壁。
- 培养瓶中加 PDL，放置至少 10 min；
- 回收 PDL，用 PBS 洗涤培养瓶；
- 加入培养基，然后再加入细胞悬浮液即可。
后记
在细胞间里待了两三天之后，我逃离 wet lab 的想法愈发坚定了。XD