最近被派出去学习细胞实验,故以此文记录我的所学所闻,加深记忆与理解。

基本注意事项

  1. 即将进入培养箱与超净台的东西(比如自己的手、培养瓶、各种器材试剂等),必须事先喷洒酒精消毒。
  2. 进入细胞间第一件事,查看自己的细胞的密度、状态,想好今天需要做什么。
  3. 想好要做的实验之后,拿出试剂预热,如培养基、胰蛋白酶等。
  4. 将自己准备用的液体药品倒入单独的离心管里待用,而不是直接使用大瓶子里的液体,避免污染。

常用的体积

  1. 养细胞时的培养基用量:小瓶 5 mL,大瓶 15 mL;
  2. PBS 洗涤时的用量:小瓶 1 mL,大瓶 3 mL;
  3. 消化细胞时的胰酶用量:小瓶 1 mL,大瓶 3 mL。

消化细胞

  1. 从培养箱取出细胞,倒掉培养基;
  2. 使用 PBS 洗涤;
  3. 加入胰蛋白酶,放入培养箱消化 3 min;(需计时,太短则无法消化完全,太长则可能破坏细胞);
  4. 取出细胞,检查状态,若消化完全,则可见细沙状沉淀,轻敲培养瓶外壁,可见脱落现象,液体混浊;若未消化完全,则继续培养直至消化完全;
  5. 加入培养基中止消化(培养基中的蛋白可以竞争胰酶对细胞的消化)(中止后,若手头还有其它实验要做,可以暂时停在这里一会儿,基本不会有问题);
  6. 把瓶子里的液体转移至离心管,用每分钟 1000 转的速度离心 3 min;
  7. 取出离心管,倒掉液体,再用移液枪吸走残余液体;
  8. 用 1 mL 或 2 mL 培养基冲洗沉淀物,用移液枪冲匀液体,即可得细胞悬浮液(混匀悬浮液时,最好用枪头冲匀,不使用涡旋是因为力度可能太大、损伤细胞,不使用摇晃是因为可能混不匀)。

细胞计数

  1. 取细胞计数板,显微镜下观察是否洁净,若不洁净,则用酒精喷洒消毒;
  2. 取一小玻片,先在计数板两边滴加少量(约100μL)PBS,用枪头涂开、涂匀,将玻片覆盖在计数板上,利用刚才的 PBS 保证结合紧密;
  3. 稀释细胞悬浮液,通常稀释 10 倍,即取一个 1.5 μL EP 管,加入 900 μL PBS,加入 100 μL 细胞悬浮液,用枪头冲匀;
  4. 取 100 μL 稀释液,滴入计数板边缘,随后液体将因表面张力而被引入计数板的凹槽;
  5. 在显微镜下进行细胞计数,记录四个 4x4 方格内的总细胞数,然后取平均,每个 4x4 方格的体积可认为是 1x10^-4 mL,由此可推算母液的细胞密度。

爬片

  1. 用干净的镊子夹取玻片置于 12 孔板中;
  2. 每个孔都用 1 mL PBS 洗涤,洗涤后吸去 PBS,尽可能吸干净;
  3. 每个孔都加入 200 μL 聚赖氨酸 (PDL),使玻片表面覆盖一层 PDL,放置至少 10 min;
  4. 将 PDL 吸走、回收;
  5. 用 PBS 洗涤每个孔,确保无游离的残余 PDL;
  6. 将预先稀释过的细胞悬浮液加入每个孔;
  7. 用摇床摇匀,然后将 12 孔板放入培养箱。

细胞传代

通常在瓶内加入培养基之后,直接加入上一代细胞的消化后的悬浮液即可,但某些细胞需要加 PDL 来帮助细胞贴壁。

  1. 培养瓶中加 PDL,放置至少 10 min;
  2. 回收 PDL,用 PBS 洗涤培养瓶;
  3. 加入培养基,然后再加入细胞悬浮液即可。

后记

在细胞间里待了两三天之后,我逃离 wet lab 的想法愈发坚定了。XD

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